Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Модификации остатка сахара

Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном / Модификации остатка сахара

Страница 1

Модификации фосфодиэфирных связей не оказывают значительного эффекта на стабильность гетеродуплекса ДНК - РНК. Поэтому, кроме модифицированных олигодезоксинуклеотидов, представляют интерес так называемые модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды второго поколения - это замещённые по 2’-гидроксильной группе остатка рибозы олигорибонуклеотиды. Такая модификации также повышает устойчивость к действию нуклеаз. Хотя РНК значительно менее устойчивы к воздействию окружающей среды по сравнению с ДНК за счёт наличия 2’-OH-группы, именно модификации по этой группе позволяют получить стабильные продукты, проявляющие меньшую токсичность по сравнению с фосфонатами. Также к модифицированным антисмысловым олигонуклеотидам второго поколения часто относят и олигонуклеотиды с модифицированным остовом не сахарофосфатной природы, например, пептидные нуклеиновые кислоты, также проявляющие нуклеазоустойчивость и образование термодинамически стабильных гибридов с молекулами мРНК-мишени.

Рис.4. Модификации второго поколения: V - 2’-O-алкил-РНК, VI - LNA, VII - Morpholino, VIII - PNA.

Анализ данных по использованию ряда 2’-O-алкильных производных РНК, содержащих от одного до пяти метиленовых звеньев в алкильном радикале, показал, что с увеличением количества метиленовых звеньев возрастает устойчивость модифицированного олигонуклеотида к действию нуклеаз (пентокси > пропокси > метокси > дезокси). Эта зависимость может объясняться стерической недоступностью нуклеотида при присоединении более объемного заместителя. Однако, стерические затруднения, вызванные наличием объёмных заместителей, снижают эффективность образования комплементарных комплексов с мРНК-мишенью, поэтому наибольшего сродства к мишени достигли при использовании малых заместителей [5-7]. При сравнении физико-химических параметров 2’-O-метилированных фосфоротиоатов (Me-S-ODN), S-DNA и немодифицированной ДНК выяснилось, что температура плавления (Tm) гетеродуплексов ДНК - РНК возрастает в следующем порядке: Me-S-ODN - RNA > normal DNA - RNA > S-ODN - RNA [6]. Недостаток данной модификации состоит в том, что РНКаза H не может расщепить мРНК-мишень в РНК - РНК-комплексе. Как следствие этого недостатка, такие олигонуклеотиды являются менее мощными ингибиторами экспрессии генов по сравнению с немодифицированными [3,5,12-15].

’-катионные модификации приводят к образованию цвиттер-ионных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды, кроме образования более стабильных гетеродуплексов, по сравнению с немодифицированными, обладают большей способностью проникать через биологические мембраны и высокую стабильность к действию нуклеаз вследствие своего заряда. 2′-O-[2-[2-(N,N-диметиламино)этокси]этил]олигонуклеотиды (2’-O-DMAEOE, см. рис 5), благодаря эффекту заряда, образуют гетеродуплексы с РНК-мишенью с температурой плавления на 2 ºС больше по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами [16]. Цвиттер-ионные олигонуклеотиды сохраняют РНКаза H-компетентность, если модификации разбросаны по всей длине олигонуклеотида.

Рис. 5. 2’-O-DMAEOE

Конформационно ограниченные «блокированные» нуклеиновые кислоты (Locked Nucleic Acids, LNA) - модифицированные нуклеиновые кислоты, имеющие как минимум один мономер с бициклической фуранозой в качестве сахарного остатка (см. рис. 4, VI). Они обладают большим сродством к комплементарной последовательности (температура плавления дуплекса возрастает на 6 °С при модификации одного нуклеотида [17]), что является и достоинством (эффективное связывание мишени), и недостатком (образование шпилек). Такое сродство необходимо учитывать при конструировании LNA [18]. Исследования на мышах показали малотоксичность LNA [19].

Пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) - аналоги нуклеиновых кислот, в которых сахарофосфатный остов заменён на псевдопептидный N-(2-аминоэтил)-глициновый полимер. N-конец иминирует 3’-конец олигонуклеотида, а C-конец - его 5’-конец (см. рис. 3, VII). Комплексы PNA - РНК более стабильны, чем комплексы ДНК - ДНК и РНК - РНК. Несмотря на то, что PNA могут связывать мишень как в антипараллельной (по Уотсону - Крику), так и в параллельной (по Хугстину) ориентации, более стабильные комплексы образуются при антипараллельной ориентации PNA. Исследования показали малую токсичность PNA [20].