Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени

Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном / Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени

Страница 1

Эффективность действия антисмысловых олигонуклеотидов количественно характеризуется сродством ODN к мРНК-мишени и эффективной константой расщепления последней.

Сродство ODN к адресуемой ему РНК (или свободная энергия образования гетеродуплекса) описывает стабильность гибрида ДНК - РНК. DrG может быть измерена калориметрически [17], либо рассчитана теоретически [34,35]. При расчете свободной энергии Гиббса образования гетеродуплекса используется закон Гесса (свободная энергия Гиббса сложной реакции не зависит от её пути) и расчеты энергий образования вторичных и третичных структур по правилу «ближайшего соседа» (nearest neighbor rule) с помощью программы mfold, разработанной Цукером и соавторами. Реакцию можно представить следующим образом:

В этой схеме М, O, H - соответственно мРНК-мишень, антисмысловой ODN и гетеродуплекс ODN - РНК с учётом их вторичной и третичной структуры, Мu, Ou, Hu - соответственно мРНК-мишень, антисмысловой ODN и гетеродуплекс ODN - РНК без учёта их вторичной и третичной структуры, DunG(M), DunG(O), DunG(H) - свободные энергии Гиббса укладки их во вторичную и третичную структуру, DrG, DrG(unfolded) - свободные энергии гибридизации ODN и мРНК в свёрнутом и полностью денатурированном состоянии соответственно.

DunG(M), DunG(O), DunG(H) и DrG(unfolded) могут быть теоретически рассчитаны. Тогда свободная энергия гибридизации находится по закону Гесса:

Константу равновесия процесса ассощиации гетеродуплекса K1 можно найти, исходя из рассчитанной свободной энергии Гиббса процесса гибридизации:

Для оценки температуры плавления гетеродуплекса также пользуются правилом «ближайшего соседа» и рассчитывают её с помощью соответствующих программ.

Экспериментально можно найти эффективную константу скорости keff брутто-реакции превращения мРНК M в условный продукт X (эта условность не влияет на результат кинетических расчетов, но значительно их упрощает):

Эффективная константа скорости брутто-реакции показывает наблюдаемую скорость расщепления мРНК-мишени.

Механизм реакции можно представить следующей схемой:

В этой схеме E - фермент РНКаза H, HE - промежуточный комплекс её с субстратом H, K1 - константа ассоциации гетеродуплекса, рассчитываемая по формуле (3).

Для данной кинетической схемы можно составить систему кинетических уравнений:

где СA - концентрация вещества A, ki - константа скорости i-й элементарной реакции.

Обычно измеряемым параметром является концентрация мРНК в растворе (исходная CM0 и текущая CM), поэтому keff считают относительно к матрице:

Использовав квазистационарное приближение по промежуточному продукту HE и упростив выражение для скорости реакции w с помощью уравнения Михаэлиса - Ментен:

где - константа Михаэиса, можно преобразовать выражение для скорости изменения концентрации гетеродуплекса H:

Найдём выражение для эффективной константы скорости расщепления мРНК-мишени в двух случаях: когда процесс лимитируется связыванием мРНК антисмысловым ODN и лимитируется каталитическим расщеплением мРНК-мишени в составе гетеродуплекса.

Случай 1. Лимитирование гибридизацией.

В этом случае процесс расщепления идёт значительно быстрей, чем гибридизация. Поэтому можно допустить предположение об установлении стационарной концентрации гетеродуплекса H, т.е.:

С другой стороны, легко увидеть (6), что:

поэтому:

То есть, в данном случае выражение для скорости расщепления мРНК совпадает по абсолютному значению с выражением скорости реакции (скорости образования условного продукта Х). Воспользовавшись этим, преобразуем выражение для скорости изменения концентрации олигонуклеотида, мы увидим, что его концентрацию можно считать практически неизменной: