Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Результаты и обсуждения

Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном / Результаты и обсуждения

Метод подавления экспрессии гена, используя антисмысловые олигонуклеотиды, предложен более 15 лет назад [], однако работы над его оптимизацией остаются актуальными и в настоящее время. Антисмысловые олигонуклеотиды являются потенциальными терапевтическими агентами, подавляющими экспрессию патогенных белков. За последние 15 лет развитие биоорганической химии позволило получить ряд химически модифицированных олигонуклеотидов, обладающих улучшенными биологическими свойствами по сравнению с немодифицированными антисмысловыми ODN: большей устойчивостью к действию нуклеаз, образованием стабильных гетеродуплексов, способностью проникать в клетку.

Эксперимент по «выключению» гена антисмысловыми олигонуклеотидами включает в себя несколько этапов:

1. Выбор и проведение необходимых для эффективного антисмыслового действия химических модификаций олигонуклеотида.

2. Оптимизация условий проведения ОТ ПЦР реального как метода, количественно измеряющего количество молекул РНК, содержащих ген-мишень.

. Доставка антисмыловых олигонуклеотидов в клетки.

. Количественная характеристика антисмыслового действия: сравнение количества мРНК-мишени в клетках, обработанных модифицированным и немодифицированным олигонуклеотидами, и в интактных клетках.

Если количество мРНК-мишени в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, мало по сравнению с количеством мРНК-мишени в интактных клетках, то антисмысловой олигонуклеотид эффективно подавляет экспрессию гена-мишени. Адекватно подобранный ряд химических модификаций должен усиливать антисмысловой эффект.

Антисмыловой агент, эффективно ингибирующий продукцию патогенного белка, должен пройти ещё ряд доклинических и клинических испытаний, прежде чем стать продажным медикаментом.

В настоящей работе в качестве модели исследования был выбран ген EGFP, продуцирующий флюоресцирующий белок. Преимуществом выбранной модели является возможность измерения экспрессии гена-мишени двумя методами: ОТ ПЦР и измерение интенсивности флюоресценции, производимой белком, кодируемым геном-мишенью.

Был проведён синтез 5’-монопиренильных конъюгатов двух антисмыловых ODN, адресованных к мРНК-мишени (EGFP-A, EGFP-B), и одного «смешанного» (scrambled) олигонуклеотида (Scr-1), содержащего разбросанные и перемешанные участки антисмысловой последовательности. Также были оптимизированы условия проведения ОТ ПЦР как метода диагностики наличия генов EGFP в образцах РНК, выделенных из клеток.