Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Постановка метода ПЦР для определения мРНК гена EGFP

Материалы по биологии и химии / Подавление экспрессии гена EGFP в клетках с использованием конъюгатов олигонуклеотида с пиреном / Постановка метода ПЦР для определения мРНК гена EGFP

Страница 1

Была проведена ПЦР с использованием пар праймеров EGFP-1,2, EGFP-3,2 и EGFP-5,6, адресованных к гену EGFP. Положительным контролем (при использовании которого достоверно идёт амплификация) являлась пара праймеров AE-7,6, адресованных к гену AML-ETO. В качестве ДНК-матрицы использовали кДНК, полученную из клеток линии R1198 и содержащую ампликоны обоих генов. На рис. 20 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделеня в нём продуктов ПЦР.

EGFP-1,2 (дорожки 1,2), EGFP-3,2 (дорожки 3,4),

EGFP-5,6 (дорожки 5,6) и AE-7,6 (дорожки 7,8).

В качестве матрицы в 2,4,6,8 использовалась кДНК клеток линии R1198,

,3,5,7 - контрольные эксперименты (без добавлен7ия матрицы в РС).

При использовании ODN EGDP-1,2 в качестве пары праймеров амплификация практически не идёт, имеет место лишь такой артефакт, как «димеры праймеров» (см. рис…). Пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 сравнимы по эффективности амплификации.

Затем для каждой пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 подбирали оптимальную температуру отжига и концентрацию хлорида магния в реакционной смеси. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.2 настоящей работы. На рис. 21 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделения в нём продуктов ПЦР.

Наиболее интенсивно флюоресцируют бенды на дорожках 44 для EGFP-3,2 и на дорожках 36,37 для пары праймеров EGFP-5,6, что соответствует оптимальным условиям проведения ПЦР с использованием данных пар праймеров.

Таблица 9. Подбор оптимальной температуры отжига и концентрации катионов мангия в РС.

Наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд для пары праймеров EGFP-3,2 соответствует максимальной концентрации катионов магния в реакционной смеси и, как следствие, большому количеству неспецифических продуктов («шмер», см. рис…). В то же время, сравнимые с этим бендом по интенсивности флюоресценции бенды дорожек 36 и 37, соответсвтующие продуктам ПЦР с использованием пары праймеров EGFP-5,6, характеризуются меньшим количеством неспецифических продуктов. Условия реакции, в которых получен продукт ПЦР, обнаруженный на дорожке 36, являются наиболее подходящими для выявления EGFP в образцах. Эту пару праймеров в дальнейшем мы и использовали для дальнейшей оптимизации условий проведения ПЦР.

Далее были подобраны оптимальные концертрации праймеров EGFP-5 и EGFP-6 и дезоксинуклеозидтрифосфатов в указанных выше условиях: температура отжига 59,5 ºС, а концентрация катионов магния в реакционной смеси 1,5 мМ. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.3 настоящей работы. На рис. 22 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после проведения в нём разделения продуктов ПЦР.

При максимальной концентрации (1 мМ) dNTP наблюдалось большое количество образующихся неспецифических продуктов при почти полном отсутствии основного. Интерес представляют условия «8» (наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд) и «4» (второй по интенсивности), т.е.:

Таблица 9. Подбор оптимальной концентрации праймеров и dNTP в РС.

Условия «4» более предпочтительны ввиду меньшего количества неспецифических продуктов, а также меньшего расхода реагентов.

Таким образом, оптимальные условия для обнаружения EGFP методом ОТ-ПЦР можно просуммировать в табл. 9.