Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Методы

Материалы по биологии и химии / Экспериментальное исследование активации системы свертывания ферментами фибринолиза / Методы

Видеомикроскопия. Эксперименты проводились на системе по видеомикроскопии [51], [52], схема которой представлена на рис.5. Для предотвращения контактной активации и стабилизации рН плазмы в течение эксперимента (при контакте с воздухом из плазмы выходит СО2, вследствие чего меняется ионный состав плазмы и ее рН) за 10 минут до проведения эксперимента в плазму добавляли КТИ в конечной концентрации 0.2 мг/мл в буфере с HEPES (pH 7.4). Подготовленная плазма инкубируется 10 мин при 37°C для предотвращения холодовой активации свертывания. Затем производится рекальцифицикация плазмы и добавляется тромболитический препарат. Конечная концентрация ТПА достигала 1.5, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/мл [53], [54], концентрация урокиназы составляла 180МЕ/мл [53], стрептокиназы - 200МЕ/мл [53], также проводились контрольные эксперименты, без добавления тромболитических препаратов. Полученный раствор заливается в кювету, в которую вставляется активатор свертывания, покрытый тканевым фактором свертывания. Кювета с растущим сгустком освещается красным светом и в течение 90 мин регистрируется изменение интенсивности светорассеяния сгустка. При образовании сгустка плазма крови переходит из жидкого в гелеобразное состояние, и вследствие этого процесса происходит изменение интенсивности светорассеяния плазмы.

Рис.5. Схема установки: Установка состоит из исследовательской кюветы (1), которая помещается в воду, находящуюся в прозрачном термостатируемом отсеке при 37°С (2), и освещается сбоку светодиодами красного цвета свечения (3). Изображение области контакта плазмы (4) с активатором (5) фокусируется на ПЗС матрице фотокамеры (6) с помощью фотообъектива (7). Оцифрованное ПЗС камерой изображение передается в компьютер.

Наблюдение за фибриновым сгустком производится по методу темного поля. Экспериментальная кювета в водяном термостате освещается сбоку под углом 45º светодиодами красного цвета (длина волны свечения 660 нм). Рассеянный сгустком свет фокусируется на цифровую видеокамеру фотообъективом.

Для проведения эксперимента, сбора и предварительной обработки данных используется специальная программа Tromboimager (ООО «Гемакор»). После помещения активатора в кювету программе дается команда начать съемку, далее каждые 15 секунд пространственная картина интенсивности светорассеяния (выдержка составляет 50 мсек) записывается на жесткий диск.

При обработке все полученные изображения полагаются симметричными относительно перпендикуляра к активатору. Это позволяет перейти от двумерных распределений интенсивности светорассеяния к одномерным на отрезках, проведенных вдоль распространения роста тромба. На первом этапе обработки данных по светорассеянию выбирается узкая полоса, перпендикулярная активирующей поверхности (репер). Вдоль этой полосы для всех моментов времени вычисляются профили интенсивности регистрируемого сигнала. При этом, для снижения шумов, производилось усреднение значений светорассеяния внутри полосы в направлении, перпендикулярно росту сгустка (т.е. параллельно активатору). Первый, фоновый, профиль светорассеяния вычитается из всех последующий экспериментальных профилей.

Планшетный фотометр: Для проверки активации протромбина и фибриногена использовался 96-луночный планшетный фотометр. В лунки с буфером (0.5% БСА, 20mM HEPES, 140mM NaCl) pH7.4 добавлялся: 1: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ]. 2: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и активным фактором XIa[240нМ]. 3: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [2мкМ] и активным фактором XIa [240нМ]. 4: фибриноген [2мг/мл] c протромбином [4мкМ] и урокиназой [1000МЕ/мл]. 5: фибриноген [2мг/мл] c активным фактором XIa[240нМ]. Измерялось светорассеяние образующегося фибрина (длина волны 450 нм). Предварительно оценивалась чувствительность фотометра по тромбину: концентрация тромбина более 1.5nM успешно регистрировалась.