Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Методы количественного анализа микробной популяции в природе

Материалы по биологии и химии / Кинетика микробного роста в природных экосистемах / Методы количественного анализа микробной популяции в природе

Страница 1

Для количественной оценки микробных сообществ в природе необходимы специальные методы, отличные от используемых при изучении лабораторных культур. Прямой подсчет клеток под микроскопом на первый взгляд может казаться весьма подходящим методом, но на самом деле он применим только для анализа проб воды. Однако даже в такой среде большинство бактерий прикреплено к частицам детрита и едва различимо при непосредственной микроскопии. Чтобы визуализировать бактериальные клетки в пробах воды, их окрашивают флуоресцентными красителями, такими как акридиновый оранжевый или 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (ДАФИ). Эти красители проникают через плазматическую мембрану и связываются либо с клеточными белками (акридиновый оранжевый), либо с двухцепочечной ДНК (ДАФИ), обеспечивая специфическое окрашивание бактериальных клеток. Однако вопреки более ранним сведениям эти красители не позволяют различать живые и мертвые клетки и среди подсчитанных с их помощью клеток может быть значительная доля мертвых. Имеется возможность специфически выявлять активно дышащие бактерии, используя новые красители, которые образуют флуоресцентные производные только после восстановления дыхательными ферментами (например, 5-циано - 2,3 - дитолил-тетразолийхлорид). Прямой подсчет с применением флуоресцентных красителей не пригоден, однако, как метод для исследования образцов осадков или почв, поскольку в этих средах слишком велик фон естественно флуоресцирующих соединений.

Другие методы, позволяющие выявлять метаболически активные клетки, основаны на применении радиоактивных меток и радиоавтографии. Для определения синтеза белка и роста клеток используют 14С-лейцин, синтеза ДНК и размножения клеток - 3Н-тимидин. Оба эти маркера использовались в прошлом главным образом для изучения проб воды и осадков, но получаемые таким способом данные нельзя считать точными, поскольку внесенный меченый предшественник частично разлагается микробами и доступная в результате информация не соизмерима с усилиями, затраченными на эксперименты.

Оценка численности клеток в бактериальных популяциях чашечным методом Коха, т.е. путем высева на плотные среды в чашках Петри и культивирования, даже при использовании сложных и относительно неспецифических сред дает весьма разочаровывающие результаты. Общее число колоний, например на казеино-крахмало-пептонном агаре, применяемом в качестве стандартной среды для учета пресноводных бактерий, обычно на 1-2 порядка ниже, чем количество клеток, определяемое путем прямого микроскопирования. Это означает, что лишь 1 - 10% клеток микробного сообщества могут давать колонии при использовании данной методики, и другие среды в этом отношении отнюдь не лучше.

Другой метод количественного учета клеток с помощью культивирования - это метод наиболее вероятного числа. Для определения числа микробов этим способом готовят последовательные разведения (1:10) исследуемого материала в пробирках с жидкой питательной средой не менее чем в трех повторностях и инкубируют пробирки в течение времени, необходимого для проявления роста (помутнения среды). Предполагая, что в последней пробирке, где после достаточного периода инкубации наблюдается рост, находилась исходно одна-единственная клетка, подсчитывают исходное число бактерий в образце. Преимущество данного метода состоит в том, что в жидкой среде в отсутствие контакта с воздухом могут расти даже довольно чувствительные к О2 бактерии, а также в том, что непосредственно в пробирках с разведениями можно определять, например, продукты метаболизма. Недостатком такого подсчета клеток является значительная статистическая неопределенность, связанная с оценкой результатов по принципу «да» или «нет» в трех независимых повторностях разведений.

Культивирование позволяет получить более достоверные сведения, если оно применяется для количественного определения конкретных метаболических групп бактерий. Так, метаногенные бактерии, растущие с использованием водорода/формиата, можно непосредственно подсчитывать в виде колоний в чашках Петри благодаря естественной флуоресценции, выявляя таким образом 20-50% клеток их популяции. Сульфатредуцирующие бактерии также довольно успешно подсчитываются путем культивирования с применением адекватных сред.

Все эти подсчеты - путем прямой микроскопии или с помощью культивирования - имеют в основе допущение, что микробные клетки распределены как отдельные единицы и в этом виде различимы оптически либо по признаку роста. Однако в природных местообитаниях микробы часто образуют более или менее крупные агрегаты или прикрепляются к поверхностям, в том числе к частицам растительного или животного детрита, осадков или почвы, поэтому для их количественного учета с использованием любого из вышеупомянутых методов необходимо предварительно отделить клетки от субстратов (поверхностей), не нарушая жизнеспособности. Возможные способы такого отделения - это встряхивание, гомогенизация или мягкая обработка проб ультразвуком в присутствии пирофосфата, хелатирующих агентов либо детергентов. Следует, однако, учитывать, что эти процедуры вызовут гибель некоторых бактерий и пригодны лишь в качестве компромиссного решения.