Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Методы выявления генов устойчивости пшеницы

Материалы по биологии и химии / Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы / Методы выявления генов устойчивости пшеницы

Страница 1

Для начала следует рассказать о ДНК. Наш геном, как и геном любого живого организма, за исключением прионов, закодирован в нуклеиновой кислоте. Нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры из нуклеотидов. В ДНК существует 4 вида мономеров, т.е. нуклеотидов, Аденин, Гуанин, Цитозин, Тимин. В их последовательности зашифрована вся информация о первичной структуре белка. Белки состоят из 22 аминокислот. Для того, чтобы закодировать 22 аминокислоты при помощи 4-х нуклеотидов, необходимо считывать их не единично, а по 3. 4 в третьей степени получается 64 варианта - вполне достаточно чтобы закодировать 22 аминокислоты. Таким образом, ДНК содержит информацию о первичной структуре белка. Молекула ДНК у эукариот двухцепочечная. Это достигается благодаря тому, что аденин комплементарен тимину, а гуанин - цитозину.

Полимеразная цепная реакция была открыта Кэрри Мюллисом в 1983 году. Она позволяет получить миллионы копий (амплифицировать) интересующего участка ДНК.

Для проведения ПЦР в простейшем случает требуются следующие компоненты:

•ДНК-матрица, содержащаятот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

•Два праймера, комплементарные противоположным концам требуемого фрагмента ДНК.

•Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pirococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pirococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

•Дезоксирибонуклеотидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

•Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

•Буферный раствор,обеспечивающий необходимые условия реакции - pH, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Для того, чтобы прошла реакция, необходимо двухцепочечную ДНК разделить на 2 комплементарных нити. Это достигается путём нагрева рабочей смеси до 93-95 градусов. Далее необходимо присоединить праймеры к комплементарным участкам. Для этого нужно снизить температуру до такого уровня, при которм праймер сможет прикрепиться к комплементарному участку. Такая температура называется температурой отжига, её можно рассчитать по формуле:

t = (A+T) x 2 + (G+C)x4 - 5C

После того, как праймер прикрепился к нужному участку, ставится оптимальная температура для работы Taq-полимеразы. Она равна 72 градусам. Следующим шагом будет повторная денатурация ДНК при 93-95 градусах. Допустим, у нас была изначально всего одна ДНК, если мы проведем 35 вышеописанных циклов, мы получим: 1х234=17179869184 копии. селекция пшеница генный молекулярный

Для того, чтобы визуализировать результаты проведенной реакции, обычно используют электрофорез. Что такое электрофорез? Разделение чего-либо с помощью электрического тока. Электрофорез проводят в геле. Гель может быть агарозным, или акриламидным. Гель делают не на основе дистиллированной воды, а на основе раствора электролитов (солей и кислот), как правило, это трис-HCL, борная кислота и ЭДТА. Электролиты служат проводниками электрического тока. Так как молекулы ДНК заряжены отрицательно, они начинают двигаться в сторону катода. Но, гель представляет для молекул довольно мощную преграду, чем они крупнее по своему размеру, тем труднее им продираться через слой молекул геля. Таким образом, более мелкие молекулы (50 bp) за час электрофореза успевают пройти несколько сантиметров, а более крупные (1000 bp), проходят от силы пару сантиметров. Мы не можем наблюдать ДНК, если ничем её не окрасить. Чтобы её было видно, используют бромистый этидий или импрегнируют серебром. Бромистый этидий кроме того, что активно связывается с молекулами ДНК, ещё и светится в ультрафиолетовом свете.