Секрет долголетия ночницы.

Биологи уже давно считают, что продолжительность жизни животного определяется очень просто: чем оно больше, тем дольше живет.

Методы выявления генов устойчивости пшеницы

Материалы по биологии и химии / Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы / Методы выявления генов устойчивости пшеницы

Страница 2

Сателлитная ДНК

Микросателлиты - (или простые короткие (тандемные) повторы) - варьирующие участки (локусы) в ядерной ДНК и ДНК органелл (митохондрий и пластид), состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований. Используются как молекулярные маркеры в определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями. Представляют собой одну из разновидностей сателлитной ДНК. Микросателлитные последовательности небольшой длины, называемые короткими тандемными повторами (2-6 нуклеотидов, от. англ. STR - short tandem repeats), используются при картировании геномов в работе с редкими видами.

Минисателлиты - поворяющиеся фрагменты ДНК длиной от 7 и более нуклеотидов. Являются одной из разновидностей сателлитной ДНК. Они встречаются более чем в 1000 местах генома человека. Используются в качестве ДНК-маркеров. Механизмами происхождения являются "проскальзывания" при репликации ДНК, точечные мутации и рекомбинация. Минисателлиты состоят из повторяющихся цепочек, преимущественно из вариантов гуанин-цитозин, длиной от 10 до 100 пар оснований.

Теоретически ПЦР открывает широкие возможности для идентификации тех или иных генов и видов. Все довольно просто. Ищем в геноме участок в котором находится ген, подбираем к этому участку специфическую и пару праймеров, которая комплементарна только искомому участку и вперед. Проводим ПЦР и точно знаем, есть ли искомый ген или нет. Проблема заключается в том, что для того чтобы найти искомый ген, узнать его последовательность, требуется очень много труда, времени, материалов, оборудования, а стало быть - денег.

Методы, использующие ПЦР, могут иметь различную степень специфичности. Некоторые методики не требуют знания последовательности ДНК, а так как сиквенс (считывание последовательности) интересующего участка довольно дорог и требует хорошего дорогостоящего оборудования, эти методы все еще часто применяются на практике.

К таким методам относится маркирование по полиморфизму длин продуктов амплификации.

• RAPD маркеры - маркеры получающиеся в результате случайной амплификации ДНК (Williams et al, 1990).

• ISSR маркеры - маркеры основанные на межмикросателитных последовательностях (Zietkiewicz et al, 1994).

• AFLP маркеры - маркеры полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (Vos et al., 1995).

AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLP анализ - сложный метод анализа, состоящий из нескольких этапов. В анализе используется праймер с искусственно добавленной последовательностью.

1. Геномная ДНК рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI) с образованием фрагментов с выступающими 3’ - концами.

2. Рестрицированная геномная ДНК легируется с адаптером, содержащим «липкие» концы для данных рестрикционных сайтов.

. Далее проводятся две последовательные ПЦР: В первой ПЦР используются праймеры полностью комплементарные адаптерам EcoRI и MseI, в результате чего образуется большое количество продуктов амплификации между адаптерами EcoRI и MseI, которые невозможно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому во второй ПЦР праймеры с адаптерами EcoRI и MseI содержат на 3’ - конце дополнительные и некомплементарные адаптерам основания (от 1 до 3) для селективной амплификации.

4. Разделение фрагментов ДНК проводят в полиакриламидном геле с радиоктивной или с флуорисцентной меткой.

Получаемый фингенрпринт ДНК обычно высоко полиморфен и как правило хорошо воспроизводим.